一、實(shí)驗(yàn)原理

 

　　紫外-可見分光光度法基于溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收。對(duì)于蛋白質(zhì)而言，其內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，這些基團(tuán)在275-280nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有一個(gè)強(qiáng)烈的吸收峰。因此，可以通過測(cè)量蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度（A），利用朗伯-比爾定律（A=ebc）來計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度。其中，A為吸光度，e為摩爾吸光系數(shù)，b為光程長(zhǎng)度，c為濃度。

 

　　二、實(shí)驗(yàn)材料

 

　　儀器：TU-1901紫外可見分光光度計(jì)、石英比色皿（1cm光程）

 

　　試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（如牛血清白蛋白BSA，已知濃度）、待測(cè)蛋白質(zhì)溶液、0.9%NaCl溶液（作為參比溶液）、雙縮脲試劑（用于其他方法時(shí)可選擇）、苯酚試劑（用于其他方法時(shí)可選擇）

 

　　工具：吸量管、比色管、擦鏡紙等

 

　　三、實(shí)驗(yàn)步驟

 

　　1.儀器準(zhǔn)備

 

　　開機(jī)預(yù)熱：打開紫外分光光度計(jì)電源開關(guān)，預(yù)熱20-30分鐘。

 

　　波長(zhǎng)設(shè)置：預(yù)熱完成后，按GOTOλ鍵，輸入所需的波長(zhǎng)（如280nm），按ENTER鍵確認(rèn)。

 

　　2.參比溶液設(shè)置

 

　　清洗比色皿：用擦鏡紙輕輕擦拭比色皿的光滑面，確保其干凈無污漬。

 

　　參比溶液加入：向比色皿中加入適量的0.9%NaCl溶液，輕輕搖勻后放入光度計(jì)凹槽中，蓋好蓋子。

 

　　調(diào)零：按ZERO鍵進(jìn)行調(diào)零操作，確保儀器讀數(shù)準(zhǔn)確。

 

　　3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

 

　　溶液稀釋：使用吸量管吸取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，加入比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至不同濃度（如0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL等）。

 

　　吸光度測(cè)量：將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次加入比色皿中，在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量各溶液的吸光度，并記錄數(shù)據(jù)。

 

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

　　4.待測(cè)樣品測(cè)定

 

　　樣品準(zhǔn)備：將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液用0.9%NaCl溶液稀釋至適當(dāng)濃度。

 

　　吸光度測(cè)量：將稀釋后的待測(cè)樣品加入比色皿中，在280nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度。

 

　　濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，查找或計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。

 

　　四、注意事項(xiàng)

 

　　儀器預(yù)熱：確保儀器預(yù)熱足夠時(shí)間，以提高測(cè)量精度。

 

　　比色皿清潔：比色皿應(yīng)保持干凈，避免劃痕和污漬影響測(cè)量。

 

　　波長(zhǎng)設(shè)置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置正確的波長(zhǎng)，通常為280nm。

 

　　參比溶液：參比溶液應(yīng)與待測(cè)溶液具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，以減少誤差。

 

　　樣品稀釋：待測(cè)樣品應(yīng)稀釋至適當(dāng)濃度，以避免吸光度超出儀器測(cè)量范圍。