細(xì)胞凋亡的檢測方法眾多，流式細(xì)胞儀檢測凋亡，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點――可以準(zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計數(shù)。因此，具有其它方法*的*性。本文主要結(jié)合我室的一些實際經(jīng)驗，力圖簡單明了的介紹流式在檢測凋亡方面的應(yīng)用。

下面是一幅凋亡過程圖。在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下，首先是細(xì)胞色素C和apa f－1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰絲氨酸外翻，這時細(xì)胞的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了改變，可以看到細(xì)胞變小，胞核皺縮；后是細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，形成凋亡小體。

在凋亡發(fā)生的各個過程當(dāng)中，都有相應(yīng)的流式細(xì)胞儀的檢測方法，我室曾經(jīng)檢測過的方法包括：

1：線粒體功能

2：DNA Cycle

3：Caspases  

4：Annexin V Assay

6：DNA Fragmentation Assays

基本上涵蓋了細(xì)胞凋亡的各個期，對各種檢測方法的原理和特點做一個簡單介紹。

線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達(dá)科為公司代理的試劑盒（產(chǎn)品編號為BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是：正常細(xì)胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光；而細(xì)胞凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無法進(jìn)入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光。可以在熒光顯微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發(fā)，其檢測波長分別是527nm和590nm。整個實驗過程操作簡單，只需要30min就可以見到結(jié)果。

Caspase家族可以檢測的分子非常多，也有不少商業(yè)的試劑盒可以應(yīng)用。即使沒有相應(yīng)的試劑盒，只要有相應(yīng)抗體基本上是可以檢測的，具體的方法是參照細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測的步驟。

在細(xì)胞凋亡過程中伴隨著一系列的形態(tài)特征改變，細(xì)胞膜的改變是這些特征中較早出現(xiàn)的一種。在凋亡細(xì)胞中，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)。Annexin－V是一種35－36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，它對PS具有較高的親和力。細(xì)胞凋亡時，可以和外翻的PS結(jié)合，從而可以檢測凋亡的細(xì)胞。發(fā)生死亡的細(xì)胞其細(xì)胞膜上的PS也外翻，因而也會陽性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin－V標(biāo)記之外，還會加一種DNA染料，常用的有PI和7－AAD，由于死亡的細(xì)胞膜通透性增高，染料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和DNA結(jié)合，從而可以發(fā)熒光，區(qū)分出死細(xì)胞。

下圖給出的是在使用FAS單抗誘導(dǎo)前后的檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)是Annexin-V FITC, 縱坐標(biāo)是PI，左上、右上、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細(xì)胞，左下象限是存活的細(xì)胞，右下象限是凋亡的細(xì)胞。

在采用Annixin V方法檢測凋亡細(xì)胞時，要特別強(qiáng)調(diào)一點：該方法適用于懸浮生長的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測。對于貼壁生長的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細(xì)胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，從而影響檢測結(jié)果。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復(fù)性較差，且需要操作時非常小心。

DNA周期檢測原本是用來反應(yīng)細(xì)胞各個期，即細(xì)胞增殖狀況的。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI，結(jié)合的特性。細(xì)胞各個期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2－M期DNA含量是G0－G1的兩倍，而S期介與兩者之間。

但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少，因而可以在細(xì)胞G0－G1期前面有一個亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。但是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時，現(xiàn)在看來，那時的實驗結(jié)果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0－G1期峰的一個峰，死亡的細(xì)胞峰離G0－G1期峰較遠(yuǎn)，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得。有其它的替代方法，*可以不用這種方法。

下圖橫軸代表PI的熒光強(qiáng)度，縱軸代表細(xì)胞數(shù)目，各個期根據(jù)熒光強(qiáng)度可以簡單的進(jìn)行區(qū)分。

晚期凋亡的細(xì)胞由于DNA的斷裂，因而可以出現(xiàn)DNA ladder，從而也就有了經(jīng)典的檢測方法TUNEl。流式也能也能進(jìn)行Tunel檢測，其檢測原理與經(jīng)典Tunel原理基本一致。以BD公司的為例，其利用TdT能將熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記到斷裂的DNA末端，從而使凋亡的細(xì)胞具有熒光。但是由于在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，細(xì)胞需要進(jìn)行固定處理，操作類似免疫組織化學(xué)法，容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒，并且嚴(yán)格的設(shè)立對照。經(jīng)過預(yù)實驗方法穩(wěn)定后再進(jìn)行大規(guī)模實驗。標(biāo)本處理后，均可以用熒光纖維鏡進(jìn)行觀察，拍照。流式檢測后，可以進(jìn)行的計算凋亡百分比。這一點，經(jīng)典TUNEl是做不到的。